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5.漂洗: 加入1 mL 75%乙醇 ,用手指将沉淀块弹起,上下颠倒几次,4℃ ,12000 rpm 离心5 min。弃上清,75%乙醇不要回流过多,可再短暂离心 ,用移液器将剩余的75%乙醇吸出。
6. 风干,溶解: 超净台中自然干燥 5-10 min,不要真空离心干燥, RNA不要完全干透 ,以防不能完全溶解;用DEPC水溶解RNA,60-65℃助溶 5-10 min 。
7. 定量: 进行Total RNA定量,如果不马上定量 ,将样品贮存于-80℃。
RNA定量
我们一般通过Nanodrop紫外分光光度计测定RNA样本在260nm处的吸光值来计算RNA含量。但是,DNA和RNA都有吸收紫外光的性质,其性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的 ,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷 、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性 。所以紫外法不能区分DNA和RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
Nanodrop紫外分光光度计可以得到以下参数:
OD230 :杂质(酚、糖原等碳水化合物)的吸光度;
OD260 :核酸的吸光度;
OD280 :蛋白质的吸光度;
OD260 /280 :纯的RNA比值在1.5 ~2.1之间 ,如果比值低,表示受到蛋白质的污染;
OD260 /230 :纯的RNA比值在2.0 ~2.5之间,如果比值低 ,表示受到有机物如糖、肽 、苯酚等的污染。
RNA完整性鉴定
我们一般使用电泳、Agilent2100等仪器来鉴定RNA的完整
RIN值
RIN(RNA integrity number)代表RNA完整性的数值,对total RNA的完整性进行数字化的评估,范围在1 ~10
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